伦敦帝国理工学院MollyMSte

研究背景

胶原纤维是全身结缔组织的主要力量来源，特别是肌肉骨骼组织，如肌腱、韧带和半月板。这些组织的特征是由大的具有分级结构的Ⅰ型胶原纤维构成，由原胶原分子组装成原纤(10-nm，最高达1μm)、纤维束(10μm)和纤维簇(μm到数mm)。在肌腱、韧带和半月板中，这些层次结构纤维提供必要的机械强度来给予人体承受载荷所需的力量支撑。肌腱、韧带和半月板的损伤是非常常见的，但是由于有限的血液供应和苛刻的负荷环境，这些组织往往很难愈合。工程置换是一种比较有前景的治疗手段，但是这种方法无法再生出足够的胶原蛋白和胶原蛋白纤维。

目前生产对齐的分级胶原纤维的方法主要是在利用机械边界条件来指导细胞生产对齐的纤维。这些系统利用细胞收缩指导胶原蛋白原纤维的排列，主要受细胞播种的低密度胶原蛋白或血纤蛋白凝胶限制。这些培养系统可以生产类似于胚胎组织的有组织的胶原原纤维。但是，由于材料的密度低，它们会发生明显的收缩，从而导致其早期破裂、难以用于治疗、且机械性能较差。从胚胎样原纤维生长为到支配成熟组织的较大纤维和束，仍然是一个挑战。最近，使用机械边界约束和高密度胶原凝胶（10–20mg/ml）在整个半月板系统中生产出了了天然大小的30–40μm直径的胶原纤维。这些是迄今为止在工程组织中开发的最大的一些纤维，但是与天然组织相比缺乏机械性能，这表明需要进一步成熟。研究表明，随着胶原蛋白凝胶浓度的增加，凝胶的细胞收缩减少，机械性能提高。高密度胶原蛋白凝胶的这些属性可以提供支持更大层次的纤维发育所需的时间和机械信号，而在低密度凝胶中尚未观察到这些信号。

工作简介

这项研究的目的是创建一个简单的具有高密度胶原蛋白凝胶的培养系统，以驱动多个肌肉骨骼组织中细胞分层纤维的形成，并研究纤维在原纤，纤维和组织水平上的成熟度，从而形成具有天然组织结构和强力的功能性骨骼肌肉组织。首先将配好的胶原蛋白溶解液与磷酸缓冲盐水(PBS)和NaOH混合，使其凝胶化，然后将此胶原溶液立即与细胞混合，获得凝胶片，然后在适宜条件下培养。边界条件通过定制的夹紧系统施加。它由一个聚砜基座组成，在每个侧面上都有凹口，可以牢固地固定凝胶。将不锈钢夹拧紧在凝胶末端，确保它们在整个培养过程中均牢固，额外的不锈钢网，可以防止滑动。研究发现，应用于高密度胶原凝胶的边界条件能够驱动腱细胞、韧带成纤维细胞和半月板纤维软骨细胞形成直径20-40μm的天然大小的分级胶原纤维。6周后，纤维组织类似于牛的幼态胶原，呈天然纤维带状分布（直径50-μm）的层次纤维束。随着时间的延长，受约束试样的拉伸性能显著提高，达到1MPa。此外，肌腱、韧带和半月板细胞产生的纤维大小不同，卷曲程度不同，GAG浓度也不同，这与各自的早期组织相对应。

图文导读

图1分层胶原蛋白组织的相对直径

图2（A）细胞接种的胶原片凝胶的形成和钳制结构的机械约束作用。（B）在整个培养过程中未固定和固定的样品的照片。（C）原始面积和构建体的质量的百分比。从第9天开始，未钳制的样品明显收缩，而钳制的样品在大约2-3周内保持其大小。比例尺=5mm，数据显示为平均值±S.E.M。，与+周和对照组组相比具有显着性（p0.05）。

图3共焦反射率（A）胶原纤维发育（B）6周夹钳组织三维重建图像灰色=胶原蛋白，绿色=细胞自荧光，标尺=50μm。（C）基于FFT的图像分析取向（1个未取向，4.5个完全取向）和平均胶原纤维直径。未钳夹的样品保持无取向，而钳夹的样品在2周前发育成排列的原纤维，并在6周前生长成明显不同的胶原纤维（箭头），与相应的少年天然组织直径相匹配。

图4低倍共聚焦反射率3D重建和偏光成像的picrosirius红染色切片，具有20倍和10倍物镜的偏振光，表明工程样品形成了直径为50-μm的纤维束（支架）的分层组织。此外，肌腱细胞在6周前发展出强的卷曲状形态，韧带成纤维细胞和半月板纤维软骨细胞培养物中也出现相似的形态（箭头）。从幼体2-6周龄幼牛获得的天然组织。

图5原子力显微镜分析6周的夹紧的构建体和2-6周的初生牛原生组织。A)代表性的2μm×2μm图像，B)地形扫描确定d周期长度。6周后，工程组织的平均d期长度与天然组织相似，但条带模式不如天然组织规则和清晰。

图6（A）夹紧固定的胶原蛋白（羟脯氨酸）含量基本保持不变，而夹紧固定的GAG含量随时间显着增加。（B）夹住6周的样本的胶原蛋白/干重（DW）为40–70％，GAG/DW为50–％。（C）夹紧固定的GAG/DW与平均胶原纤维直径显着相关，而固定的胶原/DW与平均胶原纤维直径不相关。

图7在0.75%应变/s的破坏条件下，所有6周的试样均具有相似的屈服强度、抗拉强度和应变响应。与韧带相比，肌腱第6周夹紧的构件对脚趾区域的应变和屈服倾向更高。

结论

本研究证明了高密度胶原凝胶在机械边界条件下培养的促进分层胶原纤维形成的潜力。尽管在本研究中观察到纤维组织和力学性能的显著改善，但仍然需要进一步的纤维成熟来匹配成熟的天然组织特性。尽管需要进一步成熟作为功能替代，细胞仍能产生组织特异性胶原蛋白组织和GAG积累，这表明该系统可以作为研究胶原蛋白纤维组织的细胞调节、SLRP调节、疾病和体外损伤的可行平台。这项研究为细胞如何在体外形成胶原纤维提供了新的见解，并为肌腱、韧带和半月板组织开发一些最具组织性的胶原支架提供了一种方法。该模型有望成为体外研究胶原纤维发育、疾病和损伤的一种有前途的工具，而且这些结构在功能性肌肉骨骼替代物方面表现出很大的前景。

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